紫外分光光度法★

    核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及堿基構(gòu)成。其中，由于堿基含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，因此具有紫外吸收的特性。核酸的紫外吸收峰在260nm處，與此同時(shí)，還能通過計(jì)算A260/A280和A260/A230的數(shù)值，估計(jì)核酸的純度。（280 nm吸光通常來自蛋白質(zhì)，而230 nm則通常來自糖類和苯酚等）。

    但是紫外分光光度法無法區(qū)分DNA和RNA，因?yàn)榫哂凶贤馕盏慕Y(jié)構(gòu)是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當(dāng)一份樣品同時(shí)含有DNA和RNA的時(shí)候，測定濃度會高于其真實(shí)濃度。

 熒光染料法 ★

    使用靶標(biāo)特異性染料，該染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結(jié)合，并在特定波長光源的激發(fā)下，發(fā)出熒光。其中，結(jié)合了核酸的熒光染料，相比那些游離的，信號可增幅數(shù)十倍至數(shù)百倍，因此可以和背景區(qū)分開來。在測量過程中，首先將待測DNA樣品與熒光染料混合，熒光染料會與DNA結(jié)合，形成熒光復(fù)合物。然后，將混合物放入Qubit測量儀器中，儀器會通過激光激發(fā)熒光復(fù)合物，使其發(fā)出熒光信號。Qubit測量儀器會根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度自動計(jì)算出DNA的濃度，基本是測序?qū)嶒?yàn)室的標(biāo)配儀器。

    目前，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質(zhì)均有特異的熒光染料，無需專門純化樣品，或者在未知污染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法  ★

    qPCR法利用熒光檢測技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR過程中熒光信號的變化情況，反映濃度的變化，*后通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣品的濃度，以達(dá)到準(zhǔn)確定量文庫濃度。由于其特異性引物僅會定量兩端接頭連接完整的文庫，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，因此qPCR法作為文庫定量的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確性**。

    文庫定量時(shí)，Qubit定的是樣本中所有核酸dsDNA的濃度（以dsDNA為例），包含未連接接頭的dsDNA片段，不能很好地體現(xiàn)出文庫中有效文庫的實(shí)際濃度，其結(jié)果一般不作為終濃度用于上機(jī)。而qPCR僅測定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)的文庫序列，非標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)序列占比較大會導(dǎo)致Qubit測定值高于qPCR濃度值。