本期，我們繼續(xù)聊聊數(shù)字PCR在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用，上期內(nèi)容：

基因突變檢測與治療反應(yīng)監(jiān)測

癌癥相關(guān)基因突變隨疾病進展或治療的進展而動態(tài)變化，因此基因突變的檢測可以用來監(jiān)測癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。

例如，KRAS基因突變在結(jié)直腸癌和胰腺癌中均有較高的發(fā)現(xiàn)率，被認為與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)及患者預(yù)后直接相關(guān)?，F(xiàn)有的檢測KRAS突變的方法有Sanger測序、二代測序、ARMS-PCR等，Sanger測序的突變檢測限約為20%；二代測序方法的突變檢測限約為5%；ARMS-PCR方法的突變檢測限在1%左右，而dPCR用于突變檢測的突變檢測限可以達到0.05%~0.10%，甚至更高（表1）。

表1不同方法學(xué)KRAS基因突變檢測限

文獻案例1：

數(shù)字PCR檢測結(jié)直腸癌患者血漿中 KRAS突變，可作無創(chuàng)生物標志物

KRAS 突變是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者對抗表皮生長因子受體治療產(chǎn)生耐藥性的原因。通過數(shù)字PCR檢測血漿cfDNA中的 KRAS 突變（“液體活檢”）已成為一種非常靈敏且有潛力的連續(xù)活檢疾病監(jiān)測的替代方案。

在這項研究中，通過ddPCR分析了10名結(jié)直腸癌患者血漿DNA中的 KRAS G12V突變，并與6名健康供體進行了比較。

結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者KRAS 突變?yōu)?5.62copies/mL（中位數(shù)），而在健康對照中僅發(fā)現(xiàn)殘留拷貝（0.62copies/mL，p =0.0066）。轉(zhuǎn)移性疾病患者的血漿KRAS G12V突變拷貝數(shù)明顯高于M0患者（中位數(shù)分別為126.25copies/mL和9.37copies/mL，p =0.0286）。

與健康對照比較，結(jié)直腸癌患者血漿中野生型KRAS和KRASG12V突變的拷貝數(shù)顯著升高。此外，在癌癥轉(zhuǎn)移的情況下，突變拷貝數(shù)會更高，說明KRASG12V突變與預(yù)后相關(guān)，如進展差、術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高、生存期短等。因此該突變可作為監(jiān)測結(jié)直腸癌疾病進展的無創(chuàng)生物標志物之一，利用ddPCR檢測結(jié)直腸患者血漿中KRASG12V突變是可取的。

文獻案例2：

使用數(shù)字PCR檢測乳腺癌和胃癌患者的HER2擴增

人表皮生長因子受體-2基因（HER2，ERBB2）編碼HER2蛋白，該HER2蛋白在正常組織中罕見表達灶，但是HER2異常擴增會導(dǎo)致HER2蛋白在乳腺癌、胃癌和其他腫瘤細胞中過度表達，其表達水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

目前，HER2基因表達檢測被廣泛用作乳腺癌和胃癌患者靶向治療的輔助診斷工具，批準用于臨床的檢測通常是基于蛋白質(zhì)水平的免疫組織化學(xué)或基因水平的熒光原位雜交，但這些檢測只能用于組織標本，無法對腫瘤細胞的HER2進行動態(tài)監(jiān)測。

為了評估該測定與目前臨床使用的測試的總體一致性，招募了206患者，并對每個樣本的FFPE組織切片進行了FISH、IHC和血液樣本數(shù)字PCR檢測。

在206例乳腺癌患者中，68例（33.01%）經(jīng)dPCR鑒定為HER2陽性。對51個IHC2+樣本進行FISH檢測，以確認HER2基因是否發(fā)生突變。FISH結(jié)果顯示11例（21.57%）為陽性，其余40例（78.43%）為陰性。乳腺癌FFPE組織樣本中dPCR和IHC/FISH的一致性為96.1%（206例中有198例），敏感性為92.65%（68例中有63例），特異性為97.83%（138例中有135例）（如下表）。

對91例胃腺癌患者進行了dPCR和IHC/FISH檢測。結(jié)果顯示，21例（23.08%）被dPCR認定為HER2陽性，70例（76.92%）為HER2陰性。IHC確定了19例陽性（20.88%）和60例陰性（65.93%）。其余12例IHC2+胃癌樣本的FISH檢測顯示2例陽性（17%）和10例陰性（83%）。胃癌FFPE組織樣本中dPCR和IHC/FISH的一致性為95.6%（87/91），敏感性為90.48%（19/21），特異性為97.14%（68/70）。

利用dPCR技術(shù)來檢測血液標本中HER2基因表達狀態(tài)，結(jié)果顯示血液標本HER2檢測的準確性與組織標本一致性很高，說明通過dPCR檢測血液中HER2表達水平是一個非常好的手段，可作為癌癥治療過程中的監(jiān)測工具。

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