目前,組織活檢是評(píng)估腫瘤分子特征的標(biāo)準(zhǔn)生物材料,但仍存在重復(fù)取材困難、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性高等現(xiàn)實(shí)問題。液體活檢是對(duì)腫瘤在體內(nèi)流出物(主要是血液)中釋放的許多成分的分析,來源于腫瘤的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)已被認(rèn)為是腫瘤生物標(biāo)志物,可對(duì)腫瘤的演變進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。然而,來源于腫瘤的DNA被體內(nèi)其他細(xì)胞釋放的DNA所稀釋,ctDNA僅占總游離DNA的0.01%,檢測(cè)ctDNA需要靈敏度較高的技術(shù),而高靈敏度的dPCR技術(shù)在檢測(cè)ctDNA上具有很大的優(yōu)勢(shì)。

應(yīng)用：ctDNA檢測(cè)與腫瘤靶向治療

肺癌是全球死亡率**的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌類型的85%。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是肺癌的主要驅(qū)動(dòng)基因。EGFR基因突變主要發(fā)生在18~21號(hào)外顯子上，采用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)靶向藥物治療會(huì)取得比較好的療效。然而，NSCLC患者在經(jīng)過靶向治療后會(huì)發(fā)生繼發(fā)性耐藥，其中50%~60%為EGFR基因T790M突變，而三代EGFR-TKI 藥物AZD9291對(duì)這類患者有較好的療效。因此，進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)對(duì)于患者治療方案的選擇以及調(diào)整是非常有必要的。

目前,《NSCLC血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》中推薦可用血漿ctDNA代替腫瘤組織進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)。利用具有高靈敏度、**定量?jī)?yōu)勢(shì)的dPCR技術(shù)來檢測(cè)ctDNA可實(shí)現(xiàn)腫瘤的“液體活檢”,可達(dá)到NSCLC患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療。

文獻(xiàn)案例1：通過dPCR動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液cfDNA中 EGFR T790M水平，有助于晚期NSCLC患者的EGFR-TKI預(yù)后

135例晚期NSCLC患者，同時(shí)采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)(ARMS)和dPCR方法對(duì)這些患者EGFR-TKI治療前后血漿中的循環(huán)游離DNA(cfDNA)進(jìn)行T790M突變檢測(cè)。

結(jié)果表明，T790M在不同DNA稀釋中的陽性信號(hào)比（紅/藍(lán)信號(hào)）為：1∶100 （115/659）、1∶300 （20/686）、1∶1000 （15/692）、1∶3000 （5/702） （圖 1） 和 1∶10000 （0/686）。因此，dPCR檢測(cè)T790M突變的檢出限約為 0.03‰ ，其檢出率高于ARMS，更加適用于T790M突變的檢測(cè)。

通過ARMS和dPCR分別在TKI前和TKI后血漿中檢測(cè)到T790M 突變（表 2）。在TKI前血漿樣本中，ARMS僅在5.5%的患者中檢測(cè)到T790M （6/103），而dPCR在31.1% 的患者中檢測(cè)到T790M（32/103）。在135例TKI后血漿樣本中，dPCR鑒定出T790M陽性樣本的頻率高于ARMS（43.0% vs. 25.2%）。

TKI治療前后血漿cfDNA中T790M突變的頻率分別為31%和43%，與在腫瘤組織樣本中觀察到的頻率相似。作為一種高靈敏度和定量的方法，dPCR已被用于評(píng)估EGFR突變，血漿cfDNA中的T790M定性和定量可以預(yù)測(cè) EGFR-TKI的存活率。此外，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) T790M 變化可能有助于確定 EGFR-TKI 預(yù)后。

文獻(xiàn)案例2：通過尿液ctDNA檢測(cè)動(dòng)態(tài)追蹤EGFR-TKI治療NSCLC患者的EGFR突變

選取150例EGFR突變并接受EGFR-TKI的患者參與研究。利用 ddPCR技術(shù)量化了尿液、血液中的EGFR突變，并與原發(fā)性癌癥組織樣本做對(duì)比。

結(jié)果表明，尿液ctDNA在檢測(cè)EGRF突變方面與組織相比有88%的一致性,且檢測(cè)靈敏度與血漿結(jié)果相當(dāng)（如圖2）。

對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)尿液細(xì)胞游離 DNA 的分析顯示與治療效果有很強(qiáng)的相關(guān)性。在監(jiān)測(cè)過程中，53%的患者檢測(cè)到繼發(fā)性EGFR T790M突變，結(jié)果與血漿ctDNA分析相印證。T790M陽性突變與野生型組相比，中位生存期降低（圖3）。

尿液樣本是無創(chuàng)且容易獲得的，尿液ctDNA可能是組織樣本EGFR突變檢測(cè)的潛在替代物,利用ddPCR技術(shù)來檢測(cè)尿液ctDNA的EGFR突變可以作為無創(chuàng)監(jiān)測(cè)TKI治療的有效手段。

參考文獻(xiàn)：

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[2] Chen S, Zhao J, Cui L, Liu Y. Urinary circulating DNA detection for dynamic tracking of EGFR mutations for NSCLC patients treated with EGFR-TKIs. Clin Transl Oncol. 2017 Mar;19(3):332-340. doi: 10.1007/s12094-016-1534-9. Epub 2016 Jul 28. PMID: 27468867.